Bradford法测定蛋白质浓度

　　（一）实验原理

　　双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋

　　白质溶液测定的方法.

　　1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法）,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白

　　质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定

　　法.

　　考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置（max）,由465nm变为595n

　　m,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.

　　在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比.

　　Bradford法的突出优点是：

　　（1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1g.这是因为蛋白质与染料结合后产生

　　的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的

　　多.

　　（2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的

　　大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.

　　因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间.

　　（3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不

　　干扰此测定法.