（一）脾细胞1．材料(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠.(2)1640培养液单克隆抗体制备流程

　　(3)2.5％FCS－1640营养液2．操作方法(1)拉颈或用CO2处死小白鼠.(2)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾.(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球.(4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中.(5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中.(6)以2.5％FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）.(7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮.(8)重复⑹、⑺步骤.(9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80％为合格.（二）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞.选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快,繁殖时间短.常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（简称SP2）；③P2—X­—Ag8·6·5·3（简称653）；④FO以653最为常用,它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane,降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（MinerolOilplasmacytoma,MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系.骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可.由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理.为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8－氮鸟嘌呤.取约1×107～6×107对数生长期（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞,在室温离心（400g）10min,沉淀以2.5％FCS—1640液再悬浮并计数.（三）饲养细胞在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）.在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞.许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞.应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境.腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠.也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等.1．材料（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只.（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）.2．操作方法（1）拉颈处死小鼠.（2）70％酒精浸泡消毒10min.（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔.（4）用注射器将4ml11.6％蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管.（5）1000r／min离心10min.（6）取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液.台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞.（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用.如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些.