RealtimePCR(实时定量PCR)

　　定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术,即实时定量PCR.实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点.实时定量PCR(real-timequantitativePCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量,不需要取出PCR产物进行分离.目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域.

　　实时荧光定量PCR技术的主要应用：

　　1.DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测,RNAi基因失活率的检测等

　　2.基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证

　　3.基因分型：例如SNP检测,甲基化检测等

　　RealtimePCR常用的两种方法分别为：Sybrgreen（荧光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）

　　SYBRgreen

　　在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步.

　　此方法适用：

　　1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上

　　2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉.

　　3、通用型方法,在国内外科研中普遍使用.

　　4、高通量大规模的定量PCR检测

　　5、专一性要求不高的定量PCR检测.

　　TaqmanProbe

　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

　　此方法适用：

　　1、具有高适应性和可靠性,实验结果稳定重复性好,特异性更高.

　　2、适用于扩增序列专一的体系的检测.

　　3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测.

　　4、靶基因的特异序列较短,无论怎样优化引物设计条件都不能解决.

　　5、存在与靶基因同源的序列,在PCR中容易出现非特异性扩增,对特异性要求较高的定量.

　　6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定.

　　（来源：GENELIFEBiotech基莱生物）